荷兰皇家艺术与科学院Hans Clevers团队商榷报谈了从妊娠8-17周（8-17GW）胎儿胰腺样品中滋生的18个东谈主胎儿胰腺类器官（hfPO）系，其中4个细胞系滋生自15-16个GW样品，在优化的培养要求下，产生腺泡、导管和内分泌谱系细胞，合手续扩增卓绝2年。单细胞RNA测序轻佻胎儿胰腺和hfPO中生分的LGR5+细胞，算作发育脉络的基础。这些LGR5+细胞与成东谈主胃肠谈干细胞分享多个象征。来自单个LGR 5+类器官细胞的类器官在体外重现了这种三能性。

著述先容

张开剩余90% 题目：Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages 杂志：Cell 影响因子：45.5 发表时期：2024年12月

#1

商榷配景

Background

胰腺具有外分泌和内分泌两种功能，其中外分泌胰腺的腺泡细胞认真分泌消化酶。尽管小鼠体内模子为胰腺发育提供了深入成见，但东谈主类胰腺生物学商榷受限于东谈主-小鼠互异，主要依赖口头学时势。近期，转录组商榷和东谈主类多颖异细胞（hPSC）分化决策为深刻胰腺细胞分化提供了新视角，尤其是B细胞的产生。类器官本事的发展，特地是从iPSC或组织驻留干细胞（TSC）助长的类器官，为模拟通盘胰腺提供了新模子，尽管它们主要聚合于产生胰岛素的B细胞。此前的商榷尝试从成年小鼠和东谈主类原发性胰腺TSC中竖立类器官，但这些模子在体外倾向于导管谱系，衰败腺泡和内分泌细胞。本商榷旨在从自然指定的胎儿胰腺TSC产生一个体外模子系统，以反应上皮胰腺的复杂性，包括腺泡和内分泌细胞，为深入深刻胰腺发育和功能提供新的视角。

#2

商榷时势

Methods

最初，从跳动妊娠周（GW）8-17的20个孤独组织样品竖立18个hfPO系的小生物库；

然后，通过mRNA-seq，转录组谱和互异基因抒发分析评估出芽和囊性hfPO之间的互异；

接下来，促进进一步老练为概况产生消化酶的腺泡细胞；

临了考据hfPO概况向内分泌谱系分化。

#3

后果

Results

1、hfPO的长久培养

对来自妊娠早期和妊娠中期的东谈主胎儿胰腺组织进行措置并包埋在基底膜提真金不怕火物（BME）基质中。3天后，在大多半培养基要求下出现小的囊性结构。10-14天后，仅在一种培养基（东谈主胎儿胰腺类器官（hfPO）培养基）中不雅察到深色的、出芽的葡萄样结构的出现。从跳动妊娠周（GW）8-17的20个孤独组织样品竖立18个hfPO系的小生物库。出芽的类器官仅出现时起原于14-16 GW样品的培养物中。“最老的"出芽系已相接培养3年。仅在出芽的类器官中不雅察到生分的嗜铬粒卵白-A（CHGA）阳性细胞（图1）。

图1.hfPO的竖立

2、出芽的类器官抒发腺泡祖细胞象征物

手动分离来自疏导系（hfPO 1、hfPO 2、hfPO 5）并在疏导（hfPO扩增）培养基中培养的出芽和囊性hfPO，以及来自纯囊性系（hfPO 7、hfPO 8）的hfPO，并通过批量mRNA测序（mRNA-seq）进行分析。转录组谱标明，囊性和出芽hfPO辞别成簇。互异基因抒发分析骄贵，与囊性hfPO比较，腺泡象征物（羧肽酶A1[CPA 1]、RBPJL和PTF 1A）的抒发在出芽hfPO中更显赫，而导管象征物（角卵白7[KRT 7]、粘卵白1[MUC 1]和CEACAM 6）的抒发更低。还不雅察到内分泌象征物（NEUR 0 G 3、CHGA和CHGB）在出芽的hfPO中的抒发。此外，来拖沓原始haPO培养基中培养的15至16个GW样品的hfPO不抒发腺泡或内分泌祖细胞基因。因此，hfPO培养基复古分化为导管，而hfPO培养基允许总计三种胰腺细胞谱系的象征物的抒发，但在15-16个GW滋生的类器官系中是独到的（图2）。

图2.出芽型hfPO与囊性hfPO不同

3、hfPO产生腺泡谱系的细胞

商榷东谈主员应用CRISPaint用荧光卵白tdTomato在C终局象征腺泡基因CPA 1和PTF 1A。这也允许随后分离和分析抒发这些腺泡基因的细胞。在hfPO骄贵于助长因子蓦然的分化培养基（hfPO-AC）培养基7天后，使用荧显豁微镜和荧光激活细胞分选（FACS）分析不雅察到基因抒发水平以及CPA 1+和PTF 1A+细胞数量的增多。这通过批量mRNA-seq进一步证实，其揭示了与腺泡细胞关系的基因的上调以及消化酶的抒发（举例，CTRB/C、CEL和CEL 2A/3A）。商榷东谈主员通过透射电子显微镜（TEM）细目hfPO的分化是否导致这种颗粒的酿成。这揭示了算作老练的进一步象征的分泌囊泡的存在。此外，使用全计数免疫荧光可视化CPA 1+和PTF 1A+细胞并证明卵白质抒发。商榷东谈主员还不雅察到消化酶胰卵白酶、RNA酶、脂肪酶、胰凝乳卵白酶和胰凝乳卵白酶样弹性卵白酶3A（CELA 3A）在卵白质水平的抒发增多以及抒发消化酶的细胞数量增多（CTRC）。通过ELISA和酶活性测定来评估胰卵白酶和脂肪酶的酶分泌。后果骄贵，自然脂肪酶在扩增（hfPO培养基）和分化（hfPO-AC）培养基下齐能分泌，但酶活性在两种要求下莫得显赫变化（图3）。

图3.hfPOs向腺泡谱系的分化

4、hfPO产生内分泌谱系的细胞

为了概况在分化后轻佻和分离内分泌细胞，商榷东谈主员生成了内分泌论说基因hfPO系。克隆CHGA-hfPO论说类器官的经受和扩增之后，在扩增培养基中不雅察到生分的dTomato+细胞。在hfPO-EC培养基中7-10天后，该数量增多5-10倍。通过mRNA批量测序，在扩增与分化培养基中培养的hfPO辞别成簇。况且，CHGA的抒发增多以及胰腺激素GCG、INS、助长抑素（SST）、GHRL和PPY的mRNA的出现。此外，TEM证实存在内分泌细胞特征性的囊泡。免疫荧光骄贵多激素细胞和单激素细胞的存在。内分泌谱系主转录因子NEUROG 360的抒发进一步复古了早期内分泌细胞的合手续荣达。hfPO产生内分泌细胞的效用在培养物中合手续存在，因为RTqPCR骄贵hfPO在体外扩增2年后仍然不错产生INS产生细胞。临了，c-肽的ELISA骄贵hfPO概况在分化后产生和分泌c-肽。总之，这复古hfPO概况产生更多分化的内分泌细胞（图4）。

图4.hfPO可向内分泌谱系分化

5、hfPO细胞概述了原代东谈主胎儿胰腺组织的关节方面

在商榷中，商榷东谈主员将hfPO-和hfPO-EC培养基中助长的hfPO的转录组数据与同样发育阶段的东谈主类胎儿胰腺组织数据集进行了对比分析。进程质地截止，三个数据聚吞并成一个包含11755个细胞的数据集，hfPO细胞占总细胞数的20%。分析后果骄贵，hfPO与胎儿组织细胞之间存在高度相通，特地是在14和16周的妊娠时间。四个主要的细胞簇被识别出来，其中三个对应于胰腺的主要细胞谱系，第四个抒发干细胞象征物如SOX9和PROM1。hfPO细胞在干细胞簇中的孝顺较为显赫。鼠胰腺多能祖细胞的象征基因在hfPO细胞中取得抒发，与东谈主类胎儿胰腺的干/祖细胞同样。此外，转录因子GATA 4/6的抒发模式与预期一致，GATA4在腺泡区室抒发增多，而GATA6定位于导管和内分泌区室（图5）。

免疫组织化学染色骄贵，hfPO与胎儿和成东谈主胰腺组织在结构和象征基因抒发上存在互异。hfPO产生的腺泡细胞与孕早期和孕中期胎儿胰腺组织在基因抒发和水平上寥落同样，而妊娠中期后期的胎儿组织更接近成东谈主组织。hfPO还能产生多种消化酶，其导管细胞与妊娠早期组织同样，并能产生MUC1。hfPO滋生的B细胞也能产生胰岛素（INS），尽管成东谈主组织中INS的抒发水平更高。总体而言，hfPO在转录组谱和消化酶、粘液及激素产生方面与胎儿现象同样，标明其概况表型复制胎儿胰腺组织的特征（图6）。

图5.hfPOs在单细胞转录组水平上转录东谈主胎儿组织

图6.hfPOs概述了东谈主胎儿胰腺组织

6、LGR 5象征东谈主类三颖异细胞

商榷东谈主员通过单细胞克隆本事培植出类器官，并将其在特定培养基中扩增10天，以指引不同的胰腺细胞红运。进程质地截止的scRNA-seq数据分析骄贵，这些类器官细胞不错分为五个主要的细胞簇，辞别代表祖细胞、腺泡祖细胞、腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞。特地是，抒发高水平的上皮干细胞象征物LGR5和TROY的细胞位于祖细胞簇的顶部。通过原位杂交和论说基因本事，商榷东谈主员证实了LGR5+和TROY+细胞的存在，并评估了它们的类器官酿成能力和干细胞性情。LGR5+细胞骄贵出更高的类器官酿成能力，标明它们具有干细胞性情。进一步的践诺骄贵，不同的培养基不错促进类器官向内分泌/腺泡或腺泡和导管细胞分化。移植践诺中，这些类器官在免疫短处小鼠中助长，并阐述出包含总计三种胰腺细胞谱系的东谈主类细胞。这些后果证实了单个LGR5+干细胞概况产生包含总计三种胰腺细胞谱系的类器官，为胰腺发育和疾病商榷提供了蹙迫的体外模子（图7）。

图7.LGR5象征三能东谈主胰腺祖细胞

小结

这项商榷告捷从15至16周的东谈主类胎儿胰腺中，竖立了一个踏实的类器官系。这些类器官概况从单个LGR5+多能祖细胞发展而来，并保合手分化为腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞的能力。这些胰腺祖细胞的长久体外扩增后劲以及易于遗传修饰的特质，为商榷东谈主类胰腺的发育、生理和疾病提供了新的践诺平台。此外，这一胰腺类器官平台有望激动再生医学的发展，通过细胞治愈或特定助长因子的靶向治愈来建造胰腺功能进军。

不同地区对东谈主类胎儿组织践诺的法律和伦理划定存在互异。LGR5+细胞被合计是东谈主类的多能胰腺祖细胞，但它们与其他祖细胞群体之间的真正关系以及这些群体的可塑性仍需进一步商榷。纠正老练的培养决策关于生成与成东谈主组织相匹配的外分泌/腺泡和内分泌细胞至关蹙迫。

参考文件

Andersson-Rolf A, Groot K, Korving J, Begthel H, Hanegraaf MAJ, VanInsberghe M, Salmén F, van den Brink S, Lopez-Iglesias C, Peters PJ, Krueger D, Beumer J, Geurts MH, Alemany A, Gehart H, Carlotti F, de Koning EJP, Chuva de Sousa Lopes SM, van Oudenaarden A, van Es JH, Clevers H. Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages. Cell. 2024 Dec 2:S0092-8674(24)01254-6. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.044. Epub ahead of print. PMID: 39626658.

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发布于：江苏省